神经营养因子，如脑源性神经营养因子（BDNF），已显示出作为神经保护剂的前景，表明它们在神经退行性疾病的治疗策略中具有潜力。然而，BDNF的固有生物活性和药物限制损害了其临床功效。研究已经记录了电针（EA）对神经变性的有益作用，可能是通过BDNF介导的机制。该研究旨在阐明EA是否可以通过刺激BDNF-TrkB信号通路在MPTP（1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶）损伤的小鼠中发挥神经保护作用。研究发现EA不仅改善了运动功能障碍，还恢复了MPTP损伤小鼠的多巴胺能神经元功能和上调的BDNF表达。有趣的是，TrkB抑制剂K252a消除了EA的神经保护作用。蛋白质印迹分析进一步证明EA可通过逆转TrkB FL和TrkB T1之间的不平衡来恢复磷酸-Akt，磷酸-ERK1 / 2和BDNF对抗MPTP神经毒性的水平。总之，本研究的结果表明，EA刺激可以改善MPTP诱导的小鼠帕金森病。这种神经保护作用可以通过恢复TrkB神经营养信号传导而部分介导。

02

图1：EA改善了MPTP损伤小鼠模型中运动功能的缺陷（A）实验设计。将小鼠随机分成三组：载体对照，MPTP +假EA，MPTP + EA。小鼠连续7天接受MPTP（25mg / kg /天）。在MPTP注射前4小时进行EA处理。处理一周后，将小鼠保持3天并通过行为测试和生化分析进行评估。（B） EA刺激图。EA应用于GV20和GV29。将针插入皮下3mm处的穴位。将电极连接到针上并用塑料线固定。EA每次进行10分钟。（C） Rotarod测试性能以评估行为障碍。记录小鼠的旋转棒时间。（D）尾部悬挂试验。在6分钟内记录小鼠的不动时间。结果表示为来自3个独立实验的平均值±SEM（n = 10），** p <0.01，*** p <0.001。

03

图2：EA减少MPTP处理的小鼠中多巴胺能神经元的损失在行为测试后，收集中脑组织并通过免疫组织化学分析进行分析。在Olympus显微镜下，在10倍放大率下从三个不同视图计数每个载玻片上的TH +细胞数。（A）显示了代表性图像（放大10倍和20倍）。比例尺分别表示100μm，50μm长度。（B）各组中TH +细胞表达的统计分析。结果表示为平均值±SD（n = 4）。* p <0.05，** p <0.01。（C）通过免疫印迹确定TH表达。裂解中脑组织并通过抗-TH和GAPDH的Western印迹分析（作为上样对照）。显示了来自每组的三只小鼠的代表性印迹。（D）免疫印迹的定量。通过ImageLab 5.1（Bio-Rad）的光密度测定法定量印迹。* p<0.05，** p <0.01。

04

图3：EA保留了BDNF-TrkB信号通路的功能。裂解中脑组织并使用针对Akt，磷酸-Akt，ERK1 / 2，磷酸-ERK1 / 2，CREB，磷酸-CRNB和BDNF的抗体通过蛋白质印迹分析，GAPDH用作上样对照。（A）提出了代表性印迹。（B） Akt，ERK1 / 2和CREB的磷酸化的定量分析。（C）通过蛋白质印迹检测的BDNF表达的定量。通过光密度法测定蛋白质条带（n = 3）的信号强度，并通过单向ANOVA定量分析。* p <0.05，** p <0.01。

05

图4：EA逆转BDNF对MPTP神经毒性的表达。将中脑冷冻切片与针对BDNF的一抗和Alexa Fluor 596-缀合的二抗一起温育。将细胞核用DAPI染色10分钟。在Zeiss LSM 780共聚焦显微镜下检查SN区域。（A）显示了具有20倍扩增的代表性图像。比例尺表示长度为100μm。（B）通过免疫染色检测的BDNF表达的定量分析。量化SN区中BDNF免疫反应细胞的数量并以平均值±SD表示（n = 3）。** p <0.01，*** p <0.001。

06

图5：EA恢复MPTP诱导的对TrkB FL与TrkB T1的比率的破坏。提取中脑蛋白并通过Western印迹分析TrkB FL（140kDa）和TrkB T1（90kDa）的表达。GAPDH用作加载控制。（A）显示了代表性的印迹。（B） TrkB FL（140kDa）表达的定量分析。（C）通过蛋白质印迹测定的TrkB T1 / TrkB FL的比例。通过光密度测定法确定每个条带的强度。通过单向ANOVA进行定量分析（n = 4）。* p <0.05，** p <0.01。

07

图6：TrkB抑制剂K252a的施用有效地消除了EA对MPTP的影响，从而损害了运动功能。在每次EA之前1小时，通过ip注射向小鼠施用K252a（5μg/ kg /天）或载体。（A） K252a对旋转棒性能测试的影响。分析每只小鼠的结扎时间。（B）通过尾部悬吊试验评估行为缺陷。记录每只小鼠在6分钟内的不动时间。结果以3次独立实验（n = 10）的平均值±SEM表示。*p <0.05，** p <0.01，*** p <0.001。

08

图7：保留的EA保持多巴胺能神经元存活可被K252a消除。将脑冷冻切片与TH抗体依次温育，然后通过DAB底物试剂盒显现。（A）显示来自每组的所示照片（放大10倍和20倍），比例尺分别代表100μm，50μm长度。（B）来自每组的TH +细胞数的统计学分析。通过Olympus显微镜，以10倍放大倍数计数每个载玻片的TH +细胞数，用于三个非重叠区域。结果表示为三次独立实验的平均值±SD。（C）提取中脑蛋白，并通过蛋白质印迹技术用抗TH和GAPDH（作为上样对照）进行探测。显示了代表性的印迹。（D）通过蛋白质印迹探测的TH表达的定量。通过ImageLab 5.1（Bio-Rad）以光密度计方法定量印迹。* p <0.05，** p<0.01。

09

图8：K252a给药可有效抑制EA增强的BDNF信号通路转导。（A）裂解中脑组织，并使用针对Akt，磷酸-Akt，ERK1 / 2，磷酸-ERK1 / 2，CREB，磷酸-CRNB和BDNF的抗体通过蛋白质印迹进行分析。显示了代表性印迹。GAPDH用作加载控制。（B） Akt，ERK1 / 2和CREB的磷酸化的统计分析。（C） BDNF表达水平的定量分析。通过光密度法测定蛋白质条带（n = 3）的信号强度，并通过单向ANOVA定量分析。* p <0.05，** p <0.01，*** p<0.001。

 

BDNF-TrkB信号传导途径的破坏与神经退行性疾病有关。基于BDNF的治疗的潜力受到转化研究中剂量和递送的阻碍。针灸和EA可能具有治疗延迟或逆转PD神经变性的潜力。早期的研究表明BDNF在EA诱导的神经保护中起作用。在本研究中，不仅验证了EA对BDNF表达对MPTP神经毒性的影响，还确定了EA对TrkB FL / TrkB T1比率和下游信号激活的影响，如PI3K / Akt和ERK1 / 2。 

 

电针结合了针灸和电刺激的传统效果，对帕金森症症状具有潜在的神经保护作用。Liang等人的早期研究。报道，对GV20和GV14的EA刺激可上调6-OHDA损伤大鼠中BDNF的表达。Kim等人应用GB34手动针刺激活神经保护PI3K / Akt通路。沿着同样的证据，林等人发现对GB34和LR3的EA刺激不仅增强了BDNF的表达，而且还诱导了MPP +诱导的大鼠模型中信号蛋白Akt和ERK的激活。经常选择诸如GB34，ST36和GV20之类的穴位来实现神经保护特性。GV20和GV29用作头皮针灸治疗神经疾病。需要更多实验来验证头皮针灸治疗PD的有效性。本研究旨在观察头皮针刺对清醒动物的治疗效果。在没有束缚的小鼠中进行EA刺激。为了避免电刺激的中断，研究在头部选择了两个穴位（GV20和GV29）。

 

脑源性神经营养因子调节多巴胺能，运动和感觉神经元的存活和活性。在PD患者中检测到纹状体和血清中BDNF表达的减少。然而，BDNF的异位过表达可以保护神经元免受小鼠中6-OHDA诱导的神经毒性。Tsukahara等还证明了BDNF对MPTP诱导的非人灵长类动物损伤的疗效。先前已经证明，针灸减少了帕金森病症状，挽救了多巴胺能神经元，并恢复了多巴胺转运蛋白对MPTP诱导的神经毒性的表达。此外，一些研究表明，EA可以通过上调BDNF，GDNF和亲环蛋白A来改善MPTP诱导的神经毒性，从而改善PD的病理变化。本研究证实，EA可以减轻运动损伤并增强多巴胺能神经元对MPTP神经毒性的存活。蛋白质印迹和免疫荧光分析进一步证实了EA刺激对SNpc中BDNF表达对MPTP诱导的破坏的影响。此外，除了观察EA对BDNF表达的影响外，还确定了TrkB受体在EA调节的神经生存中的作用。

 

众所周知，BDNF通过与TrkB相互作用调节神经元存活。但是，TrkB以两种不同的形式存在：全长和截短。TrkB FL是BDNF的高亲和力受体，并且在成年大脑的不同区域广泛表达，例如，海马，纹状体和皮质。在生理条件下，BDNF结合诱导功能性TrkB FL的二聚化并引发酪氨酸磷酸化和相关的细胞神经保护信号。与TrkB FL相反，TrkB T1主要是阴性同种型。TrkB T1的上调通常表明TrkB FL介导的信号功能障碍导致神经变性。因此，TrkB T1被认为是治疗神经退行性疾病的潜在靶标。最近的一项研究报道，PD患者的SNpc和纹状体中TrkB FL与TrkB T1的比值发生了改变。然而，在动物模型中未检查EA刺激对TrkB FL与TrkB T1的比率的影响。在本研究中，检测了MPTP暴露后两种TrkB同种型的水平以及通过蛋白质印迹进行的EA处理。本研究的关键发现是EA刺激可以拮抗MPTP对TrkB FL和TrkB T1形成的影响。已经充分证明神经毒素MPTP对线粒体功能和钙蛋白酶过度活化的影响。钙蛋白酶激活直接增强TrkB T1的表达。这些结果最终揭示了MPTP增加TrkB T1水平的机制。然而，EA刺激恢复了TrkB FL和TrkB T1之间的平衡，可能是通过阻止MPTP诱导的TrkB FL切割或下调TrkB T1表达。已充分确定TrkB活化启动涉及MAPK，ERK，磷脂酶Cγ和PI3K / Akt的几种信号传导途径的激活。TrkB FL / TrkB T1比率的破坏通常改变细胞信号转导。我们对ERK1 / 2和Akt磷酸化的结果也表明EA处理确实增加了磷酸化ERK1 / 2和磷酸化Akt的水平（如图3A，B所示）。为了进一步证实TrkB受体参与EA诱导的神经保护作用，我们使用了TrkB抑制剂K252a。正如预期的那样，K252a完全废除了EA的有益作用，如行为障碍和多巴胺能损失所示。此外，K252a还消除了EA对细胞内BDNF / TrkB信号转导激活的影响。目前的研究结果表明，EA调节的BDNF升高是通过逆转TrkB FL和TrkB T1之间的不平衡来实现的。

 

本研究表明EA对中脑多巴胺能神经元中MPTP诱导的神经毒性具有保护作用，并且EA改善了小鼠PD模型中运动功能的损伤。EA主要恢复BDNF-TrkB信号通路的激活。重要的是，EA治疗似乎是治疗PD的有前景的方法。考虑到BDNF调节异常的一般影响，EA可能是针对PD症状的强大的非药物神经保护策略。需要进一步的工作来验证EA的治疗功效并阐明其对PD的神经保护机制。

 

文献来源：Zhao Y, Luo D, Ning Z, et al. Electro-Acupuncture Ameliorated MPTP-Induced Parkinsonism in Mice via TrkB Neurotrophic Signaling[J]. Front Neurosci, 2019,13:496.