摘要

 

尽管拔罐疗法历史悠久，但其临床疗效仍存在争议。由于短期暴露于真空条件中很少能影响细胞活动，至今仍缺乏直接证据来证明拔罐疗法的生物学作用，在这项研究中，研究人员将一种新的医学技术---低温等离子体的特性添加到经典的拔罐疗法中，并命名其为“等离子拔罐”(PC)。研究结果表明，相对于正常大气压(760 Torr)，等离子在类似拔罐的半真空条件下(410 Torr)产生的几率增加。值得注意的是，尽管拔罐疗法很少能影响血管内皮生长因子(VEGF)-A，经PC处理后的HaCaT人角质形成细胞能显著诱导VEGF-A的表达。经PC处理后VEGF-A基因表达的增加可能是PC介导的ERK蛋白激活的结果。PC介导的ERK激活是缺氧诱导因子1α(HIF-1α)激活的前提，而ERK的激活有可能是PC介导的VEGF-A表达的原因之一。由PC介导的NO的增加被认为是HIF-1蛋白活性升高的主要原因。PC除了具有促进血管生成的作用外，还通过TNF-α介导的IL-1β和IL-6的表达而发挥抗炎作用。总之，这项研究表明，PC可以通过在传统拔罐基础上增加低温等离子的特性来提高临床效果。

 

低温等离子体

 

低温等离子体(NTP)作为一种新的医学技术被引入。在物理学中，“等离子体”一词代表电离气体状态。当向中性气体中加入过多的能量或热量时，物质的电子就会分离，气体就会被电离。

大约20年前，NTP的产生技术得到了发展，它相关的生物学和药物效应开始被阐明。研究表明，NTP有抗菌及促伤口愈合的作用。此外，NTP还可以增强经皮给药的有效性，可能有助于治疗各种类型的肿瘤。既往研究表明，NTP可有效诱导皮肤细胞中VEGF-A的表达。

因此，如果将NTP的这些药物作用与拔罐结合起来，这种新的等离子体拔罐技术(PC)不仅可以增强传统拔罐的临床疗效，而且可以扩大拔罐治疗的应用范围。

实验结果

 

拔罐可以促进等离子体的产生，并且促进VEGF-A基因的表达。HaCaT人角质形成细胞在拔罐、空气等离子体（airP）、等离子体拔罐（PC）的条件下培养5分钟，经6小时孵育后，VEGF-A mRNA的含量如下图。与空白组相比，PC可以显著提升VEGF-A的含量（7.8倍）。

 

 

PC处理后的HaCaT细胞可以轻微诱导HIF-1α蛋白表达，同时激活ERK和JNK激酶。

HaCaT细胞在拔罐、airP、PC中培养5分钟，后孵育4小时，HIF-1α、ERK和JNK的蛋白表达量如下图。airP和PC可以提高HIF-1α水平（1.7倍和2.6倍），提高ERK活性（1.5倍和2.1倍），提高JNK活性（2.2倍和3倍）。但拔罐只能轻微提高HIF-1α的表达，提高JNK活性（1.5倍），不能提高ERK活性。

HaCaT细胞分别在收获前0.5小时、1小时、2小时、4小时经PC处理，后对细胞溶解物进行分析。运用CoCl2处理细胞作为阳性对照。与CoCl2相比，PC诱导HIF-1α表达的效应较弱，激活ERK的效应较强，PC处理1小时后，JNK的活性增强，但效应弱于CoCl2。

 

 

 

在JNK失活条件下，PC处理可使PC介导的HIF-1α的表达略有减少，而VEGF-A的表达增加。SP600125可使ERK1的活性升高，而PC处理可进一步增强ERK1的活性。相反，ERK抑制剂可完全阻断PC介对VEGF-A的诱导作用，但对HIF-1α的影响不大。

许多研究表明，等离子体介导的细胞内ROS增加是其若干生物学功能产生的关键因素之一。为观察ROS在PC介导的VEGF-A表达增加中的作用，用PAN-ROS清除剂NAC处理HaCaT细胞，并观察PC对HaCaT细胞反应的影响。数据显示，NAC成功地阻断了PC介导的VEGF-A基因和HIF-1α蛋白表达的增加，以及PC介导的ERK的激活。

 

 

PC介导的HIF-1α的激活对VEGF-A基因表达至关重要。为了验证PC介导的ERK激活是否与HIF-1α蛋白的活性直接相关，本实验观察了拔罐、airP和PC对HIF-1α蛋白定位的影响。数据显示，HIF-1α蛋白在未处理的HaCaT细胞中很少出现。拔罐对其无明显影响。经PC处理后，大多数HaCaT细胞均有核样HIF-1α表达。

另外，为了探讨HIF-1是否在PC介导的VEGF-A表达增加中起重要作用，我们使用了针对HIF-1α的siRNA。结果显示，转染的HaCaT细胞经PC处理后，可诱导VEGF-AmRNA和HIF1α蛋白的表达，但针对HIF1α的siRNA可完全阻断PC介导的对VEGF-A的诱导作用。

 

 

PC处理后NO的升高可能是PC介导的VEGF-A表达的原因之一。

为观察PC在VEGF-A调节中的作用，我们采用了三种不同的PC处理方法，分别为直接处理(DT)，间接处理(IDT)及DT和介质变化(DT-MC)。在3种不同的PC处理后6h，检测VEGF-A基因的表达水平。IDT对PC诱导的VEGF-A mRNA表达水平与DT诱导的VEGF-A mRNA表达水平相似(7.1倍和7.8倍)。经DT-MC方法处理的细胞VEGF-A基因表达仅略有增加(1.66倍)。

 

 

 

验证PC刺激后N2的增长是否能调节细胞生长介质中的RNS水平，分别用或不用PC处理，5分钟后，测定亚硝酸根离子(NO2−)的水平。结果显示，正常生长培养基中NO2−水平约为3μM，PC处理后约为60μM。为探讨细胞生长培养基中各组分对PC介导的NO2−产生的影响，将含10%胎牛血清的细胞生长培养基(GM)、无血清培养基(SFM)和DPBS分别置于PC处理5min后，检测其NO2−水平。结果显示，PC处理组的NO2−水平(92.7%)与PC处理组相似(92.7%)，而PC处理组的NO2−水平约为PC处理组的一半(51.2%)。这些数据不仅证明了PC处理的GM中NO2−的升高不是由血清中蛋白质引起的Griess实验误差，而且还表明GM的非蛋白质成分是半数PC介导的NO2−生成的来源。

 

 

 

讨论

本研究结合了传统拔罐疗法和新的医疗技术NTP。研究主要集中在传统拔罐的基础上加入NTP的促血管生成特性。此外，还探讨了PC介导VEGF-A表达的分子机制。由于PC刺激HIF-1的激活，而HIF-1对促进创面愈合非常重要，因此PC有望缩短拔罐所导致的皮肤组织损伤的愈合时间。在之前的研究中，我们报道了NTP12的强抗炎活性。PC还能有效地阻断TNF-α介导的促炎细胞因子在HaCaT细胞中的表达。提示PC不仅能促进血管生成和伤口愈合，而且可能有助于治疗炎性肌肉疼痛。