非小细胞肺癌（non-smallcell lung cancer，NSCLC）是致死率极高的一类恶性肿瘤，居我国恶性肿瘤发病率及致死率之首[1]。近年来，肿瘤免疫治疗成为研究的热点，同时给NSCLC药物研究带来新希望。机体免疫系统通过免疫监视清除肿瘤细胞，然而当程序性死亡分子1配体（PD-L1）高表达后，导致机体免疫功能被抑制，肿瘤细胞逃避机体免疫监视和T细胞的杀伤作用[2]。研究表明，在NSCLC实体瘤中常见PD-L1过度表达[3]。因此，寻找抑制PD-L1的药物将成为治疗NSCLC的新方向。

人参皂苷Rg3是多种人参皂苷成分中免疫调节作用最显著的小分子物质，研究表明人参皂苷Rg3可通过多种途径增强机体对肿瘤细胞的免疫能力[4]。然而人参皂苷Rg3与免疫检查点之间的关联研究较少。人参皂苷调节免疫发挥抗肿瘤的作用是否与调控PD-L1表达有关尚不明确。本研究对人参皂苷Rg3影响PD-L1表达的作用进行研究，并初步探索其作用机制，为抑制PD-L1的中药新药开发提供参考。

1  材料

1.1  细胞

小鼠非小细胞肺癌Lewis细胞（LLC）源于ATCC细胞库。

1.2  药品与试剂

人参皂苷Rg3（成都曼思特生物科技有限公司，质量分数98.44%，批号MUST-16030711）；DMEM基础培养基、胎牛血清（Gibco公司）；RIPA裂解液＋PMSF（北京鼎国昌盛生物技术有限公司）；磷酸酶抑制剂（江苏凯基生物技术有限公司）；ECL化学发光试剂盒（Millipore公司）；MTT（Promega公司）；γ干扰素（IFN-γ，Peproted公司）；IFN-γ稀释液（杭州联科生物技术有限公司）；流式细胞术PD-L1抗体（eBioscience公司）；免疫荧光PD-L1抗体、GAPDH抗体（Proteintech公司）；哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）抗体（Abclonal公司）；蛋白激酶B（Akt）、p-Akt、PI3抗体（CST公司）；山羊抗小鼠IgG H&L（Abcam公司）；二抗（Bioword公司）；DAPI染色液（Beyotime公司）。

1.3  仪器

CO2细胞培养箱，Thermo公司；酶标仪，美国BioTek公司；Flow Cytometer C6流式细胞计数仪，BD公司；荧光倒置显微镜，Zeiss公司；凝胶成像系统，美国Bio-Rad公司。

2  方法

2.1  MTT法检测人参皂苷Rg3对LLC增殖的影响

DMEM完全培养基（DMEM基础培养基＋10%胎牛血清＋青霉素＋链霉素）培养LLC，PBS清洗2遍，胰酶消化，离心后计数，调整细胞数为8×103个/mL，接种于96孔细胞培养板，每孔加入200μL细胞悬液，培养12～24 h细胞待贴壁并显示形态。实验分为对照组及人参皂苷Rg3 1、2、4、8、16、32、64、128 μmol/L组。每组设置6个平行孔。5% CO2、37 ℃的饱和湿度培养箱孵育24、48 h后，弃去上清，各孔加入100 μL基础培养基DMEM和MTT 10 μL，孵育4 h，移除上清，各孔加入DMSO 100 μL溶解，震荡5 min混匀后，在490 nm处读取其吸光度（A）值。

2.2  长时程细胞动态监测人参皂苷Rg3对LLC增殖的影响

DMEM完全培养基培养LLC，PBS清洗2遍，胰酶消化，离心后计数，调整细胞数为8×103个/ mL，接种于96孔细胞培养板，每孔加入200 μL细胞悬液，培养12～24 h待细胞贴壁并显示形态。实验分组同“2.1”项。给药后置于CO2细胞培养箱中，培养24、48 h，每小时拍照记录进行细胞长时程动态监测。

2.3  流式细胞术筛选IFN-γ诱导PD-L1表达的有效浓度

取对数生长期的LLC，PBS清洗2遍，胰酶消化，离心后计数，调整细胞数为1×105/mL，接种于6孔板上，每孔加入2 mL细胞悬液。提前用稀释液配制不同质量浓度的IFN-γ。细胞分为IgG阴性对照组及IFN-γ 10、20、30 ng/mL组，每组设置3个平行对照孔。各组分别加入对应药物继续培养24 h，PBS清洗2遍，不含EDTA的胰酶轻轻吹打消化，1 000r/min、5 min离心后计数，调整细胞数为5×106个/mL。除阴性对照组外各组每200 μL体系加入1 μL PD-L1抗体，阴性对照组每200 μL体系加入1 μL山羊抗小鼠IgG。常温孵育15 min后500×g离心5 min，弃上清加入100 μL PBS重悬，采用Flow Cytometer C6检测PD-L1表达。

2.4  流式细胞术检测人参皂苷Rg3对LLC PD-L1表达的影响

取对数生长期的LLC，PBS清洗2遍，胰酶消化，离心后计数，调整细胞数为1×105个/mL，接种于6孔板，每孔加入2 mL细胞悬液。实验分为对照组、模型组及人参皂苷Rg316、32、64、128 μmol/L组，每组设3个平行孔。除对照组外每孔分别加入20 ng/mL的IFN-γ诱导PD-L1表达，培养24 h后，各给药组分别给予不同浓度的人参皂苷Rg3，对照组及模型组加入DMSO。继续培养24 h，检测各组PD-L1表达，方法同“2.3”项。

2.5  免疫荧光法检测人参皂苷Rg3对LLC PD-L1表达的影响

取对数生长期的LLC，PBS清洗2遍，胰酶消化，调整细胞数为1×105个/mL，接种于6孔板（内含细胞爬片），每孔加入2 mL细胞悬液。实验分组及处理同“2.4”项。继续培养24 h后，PBS洗涤，多聚甲醛固定10 min，0.1% TritonX-100透化10 min，1% BSA室温封闭30 min，一抗PD-L1（1∶10）4 ℃孵育过夜，山羊抗小鼠IgG（1∶1 000）4 ℃孵育2 h，Hochest33342孵育5 min，封片，荧光倒置显微镜下观察，放大400倍拍摄。

2.6  Western blotting法检测PI3K/Akt/mTOR通路相关蛋白表达

取对数生长期的LLC，接种于6孔板。实验分为对照组、人参皂苷Rg3 16、32、64 μmol/L组。培养24 h后，对照组给予DMSO，各给药组给予不同浓度人参皂苷Rg3。继续培养24 h，PBS清洗2遍，加入细胞裂解液（RIPA裂解液-蛋白酶抑制剂-磷酸酶抑制剂100∶1∶1）冰上裂解细胞，离心取上清，加入5×loading buffer（1∶4），100 ℃变性10 min，样品保存于−20 ℃。蛋白样品上样量25 μg，电泳条件40 A，100 min，转膜条件100V，90 min。加入一抗（mTOR、Akt、p-Akt、PI3K）4 ℃孵育过夜，二抗室温孵育2 h，TBST洗涤后ECL发光液显影。使用Gelpro凝胶分析软件进行蛋白条带灰度分析。

2.7  统计学分析

采用SPSS 17.0软件对实验数据进行统计学处理分析，结果以表示，各组间采用单因素方差分析比较，样本均数间比较采用LSD-t检验。

3  结果

3.1  人参皂苷Rg3对LLC增殖的影响

不同浓度的人参皂苷Rg3作用于LLC 24、48 h后，MTT结果显示（图1），人参皂苷Rg3在浓度为16、32、64、128 μmol/L时能够显著抑制LLC增殖，其他浓度下人参皂苷Rg3未明显抑制LLC增殖。24、48 h长时程细胞动态监测显示（图2），人参皂苷Rg3呈浓度依赖性地抑制LLC增殖。由此可见，人参皂苷Rg3能够显著抑制LLC增殖，其抑制作用呈现出时间和浓度依赖性。

3.2  IFN-γ诱导PD-L1表达的浓度筛选

IFN-γ是协调肿瘤免疫应答的中枢细胞因子之一。肿瘤浸润淋巴细胞产生IFN-γ，进一步启动细胞周期停滞并诱导相邻肿瘤细胞的细胞凋亡[5]。然而，研究表明IFN-γ通过调控细胞周期素依赖蛋白激酶5（CDK5）上调PD-L1表达，促进肿瘤细胞免疫逃逸[6]。本实验分别采用10、20、30ng/mL的IFN-γ诱导PD-L1表达，结果（图3）显示IFN-γ质量浓度高于20 ng/mL时显著增加LLC中PD-L1的表达（P＜0.001）。因此，在后续实验中选用20 ng/mL IFN-γ构建PD-L1高表达的LLC体外实验模型。

3.3  人参皂苷Rg3对LLC PD-L1表达的影响

IFN-γ诱导PD-L1表达后，分别以人参皂苷Rg316、32、64、128 μmol/L干预LLC。免疫荧光结果显示（图4），与对照组比较，模型组PD-L1高表达于LLC细胞膜表面（红色），人参皂苷Rg3干预后，PD-L1表达显著降低（P＜0.01、0.001）。流式细胞计数结果显示（图5），与对照组比较，模型组细胞PD-L1表达显著增加（P＜0.001）。与模型组比较， 人参皂苷Rg3呈浓度依赖性地降低PD-L1的表达（P＜0.05、0.001）。

3.4  人参皂苷Rg3对PI3K/Akt/mTOR通路相关蛋白表达的影响

进一步研究人参皂苷Rg3的作用机制，由于PI3K/Akt/mTOR信号通路与PD-L1表达存在关联。因此检测肿瘤细胞中PI3K、mTOR、Akt、p-Akt的表达情况。Westernblotting结果表明（图6），人参皂苷Rg3 16 μmol/L组细胞p-Akt表达水平显著降低（P＜0.05）；人参皂苷Rg3 32 μmol/L组细胞mTOR、PI3K、p-Akt表达显著降低（P＜0.05、0.01）；人参皂苷Rg364 μmol/L组细胞mTOR、PI3K、p-Akt表达显著降低（P＜0.01、0.001）；各浓度下人参皂苷Rg3均不显著影响细胞Akt表达。人参皂苷Rg3可能通过下调PI3K、mTOR表达，抑制Akt活化，从而阻断PI3K/Akt/mTOR信号通路，进一步降低LLC表面PD-L1表达，阻断肿瘤细胞逃避免疫应答。

4  讨论

在传统中医学中，人参具有大补元气、复脉固脱、补脾益肺等功效[7]。人参中有效活性成分人参皂苷在调节免疫方面的作用尤为显著。现代药理学研究发现，人参皂苷通过以下方式影响机体免疫系统：通过保护固有免疫器官胸腺、脾脏、淋巴结等发挥抗病毒作用；增强树突状细胞、吞噬细胞、NK细胞等固有免疫细胞的免疫应答，杀伤病毒感染细胞及肿瘤细胞；调节细胞因子、补体等免疫分子产生免疫调节效应[8-10]。人参中含有近50种人参皂苷成分，其中多种成分均具有显著的抑制肿瘤细胞增殖、转移的作用。人参皂苷Rg3为四环三萜类原人参二醇型皂苷，存在2种构型，分别为20 (S)-型和20 (R)-型，其中20 (S)-型Rg3具有显著抗肿瘤效应，是众多R型人参皂苷中调节免疫和抗肿瘤作用最显著的有效成分[11]。

PD-L1表达于多种肿瘤细胞表面，其与T细胞上的PD-1相结合后，导致T细胞失活，无法杀伤肿瘤细胞，最终诱导免疫逃逸。NSCLC是最具攻击性和破坏性的恶性肿瘤之一。在NSCLC实体瘤中常见PD-L1过度表达，虽然PD-L1作为肺癌的生物标志物还存在争议，但是肿瘤细胞发生免疫逃逸的微环境中PD-L1的高表达值得关注[12-13]。免疫应答微环境涉及多种信号调节，包括信号传导及转录激活因子STAT3、Akt/mTOR或编码RAF家族丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶BRAF的突变[14-15]。PD-L1的调节是复杂的，取决于潜在的转录和信号转导网络状态以及蛋白翻译水平。PI3K/Akt/mTOR信号通路是多种细胞过程中的重要调节因子，在70%的NSCLC病例中发生Akt/mTOR过度活化[16]。因此，PI3K/Akt/ mTOR通路与PD-L1存在紧密关联，抑制PI3K/Akt/ mTOR通路能够抑制PD-L1表达，阻断肿瘤细胞免疫逃逸。

目前，人参皂苷Rg3对PD-L1的作用研究较少。本研究通过MTT法及长时程动态监测验证人参皂苷Rg3可显著抑制LLC增殖。流式细胞术及免疫荧光结果显示人参皂苷Rg3调控IFN-γ诱导的PD-L1高表达。并且免疫印迹结果表明该作用通过PI3K/Akt/mTOR通路介导，从而增强T细胞的肿瘤细胞杀伤作用，抑制LLC增殖。本研究从免疫检查点PD-L1角度揭示了人参皂苷Rg3调节免疫、抗肿瘤的作用，为相关新药的研究提供了依据。

然而，本研究仅涉及体外实验部分。后续实验将对照人参皂苷Rg3对免疫正常小鼠以及免疫缺陷裸鼠的LLC移植瘤模型的影响进行体内验证，以及对人参皂苷增强T细胞活力的具体机制进行深入研究，以阐明人参皂苷Rg3通过调节免疫检查点PD-L1抑制NSCLC发生发展的机制。

参考文献（略） 

来  源：王  蔚，王  旭，余苏云，黄  帅，丁语石，陈文星，王爱云，陆  茵. 人参皂苷Rg3调节免疫检查点PD-L1抑制肺癌Lewis细胞增殖的作用及机制研究 [J]. 中草药, 2019, 50(1):166-171.