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电针通过自主神经系统提高内毒素血症大鼠的存活率
来源:针灸最前沿 2019-07-24 [科技] [中国中医药]

背景:最近的进展表明自主神经系统和先天免疫系统之间存在复杂的相互作用。正在开发用于治疗败血症的靶向神经网络作为治疗策略。因为选择穴位的电针可以调节自主神经系统的活动,我们测试了电针在特定穴位可以调节全身炎症反应并通过其对败血症大鼠模型中的自主神经系统的影响来提高存活率的假设。

方法:Sprague-Dawley雄性大鼠在致死剂量的腹膜内脂多糖注射(6mg/kg)之前和之后1,2和4小时接受电针45分钟。结果包括存活和全身细胞因子反应。此外,还评估了神经回路的可能作用,包括下丘脑 - 垂体 - 肾上腺轴和自主神经系统。

结果:合谷穴位的电针预处理可显着减轻全身炎症反应,并使致死性内毒素血症大鼠的存活率从20%提高到80%。这种位点特异性作用需要激活中枢神经系统中的毒蕈碱受体,但不会增加中枢交感神经张力。在周边协同而非独立的情况下,交感神经和副交感神经系统的作用也是必要的。

结论:电针预处理对致死性内毒素血症的大鼠具有显着的存活增强作用,其涉及自主神经系统的传出神经回路的激活(例如,胆碱能抗炎途径)。该方法可以作为脓毒症或与过度炎症相关的围手术期病症的预防性治疗。

 

材料和方法

成年雄性Sprague-Dawley大鼠(200-300g)在22℃下以12小时光/暗循环饲养。脂多糖(大肠杆菌  0111:B4),普萘洛尔,酚妥拉明,可乐定和美卡拉明得自Sigma。阿托品硝酸甲酯获自International Laboratory USA。将所有测试试剂溶解在生理盐水中。

电针:本研究中使用的针灸穴位为合谷和内关,位于桡侧屈肌桡侧沟和颅内侧。位于掌骨尺骨侧的一组非穴位作为对照。将不锈钢针两侧插入至5mm的深度,然后用塑料胶带固定。使用电刺激装置进行刺激 45分钟。

化学性交感神经切除术、迷走神经切除、脾切除-详见原文

实验1:电针对生存的影响

在戊巴比妥钠麻醉下(50 mg / kg,腹腔注射),大鼠在注射腹腔脂多糖(6 mg / kg)之前和之后1,25或4小时接受电针治疗:合谷,内关或非穴位 。接受一组接受戊巴比妥麻醉和脂多糖而不是电针的大鼠作为空白对照。在接下来的7天内观察到存活率。n=20。该实验表明电针对合谷的保护效果优于内关和非穴位,但仅在脂多糖激发之前(图1)。因此,选择合谷穴位的电针预处理进行后续实验。

 

 

图1 电针预处理提高内毒素血症大鼠存活率

实验2:电针对全身炎症反应的影响

在脂多糖激发之前,大鼠在Hegu接受电针或在非穴位进行电刺激。接受一组接受脂多糖和麻醉的大鼠作为另外的对照。脂多糖注射后2、4、6小时测定血清促炎细胞因子TNF-α,IL-6和IL-1β和原型抗炎细胞因子IL-10用ELISA(R&D Systems; Minneapolis,MN)。在每个时间点,包括如上所述的三组(每组n = 6或10)以获得血液样品。

实验3:下丘脑 - 垂体 - 肾上腺轴的作用

下丘脑 - 垂体 - 肾上腺轴是中枢神经系统调节免疫功能的主要通道之一,并通过皮质类固醇的抗炎作用提供重要的炎症生理反馈环。为了检测下丘脑 - 垂体 - 肾上腺轴的激活是否与电针的保护作用有关,在电针预处理或非穴位后电刺激和脂多糖激发后2小时立即测量血清皮质类固醇。接受一组接受脂多糖和麻醉的大鼠和一组仅接受麻醉的大鼠作为另外的对照(每组n = 10)。使用免疫测定试剂盒(R&D Systems)测定皮质酮水平。

实验4:交感神经系统的作用

在这一系列实验中,将大鼠与下述药物在10分钟,在合谷电针之前:中枢作用的α2 -激动剂可乐定(20微克/千克,腹腔内注射),α肾上腺素能拮抗剂酚妥拉明(1毫克/千克,腹膜内注射),β-肾上腺素能受体拮抗剂普萘洛尔(5mg/kg,腹膜内注射)或盐水(每组n=20),然后进行脂多糖刺激。在电针和脂多糖刺激之前,另一组大鼠接受化学交感神经切除术。生存是主要终点。在相同设计的单独实验中,检查脂多糖后2小时的血清TNF-α(每组n = 6)。

实验5:副交感神经系统的作用

在这一系列实验中,大鼠在电针合谷之前用以下药剂治疗:毒蕈碱受体拮抗剂阿托品甲基硝酸盐(5μg/ kg;麻醉下脑室内注射); 烟碱受体拮抗剂美加明(1mg/kg;腹腔注射); 阿托品硝酸甲酯(1mg/kg;腹腔注射); 或生理盐水(脑室内注射作为阿托品甲基硝酸盐的对照;腹膜内注射作为美卡拉明或阿托品甲基硝酸盐的对照;每组n=20),然后进行脂多糖刺激。值得注意的是,烟碱受体拮抗剂美加明,本研究中使用的剂量为1mg/kg,和阿托品硝酸甲酯不能穿透血脑屏障。电针预处理和脂多糖攻击前迷走神经切断,脾切除,或假手术大鼠的单独的基团也被列入本实验(每组n=20)。生存是主要终点。在相同设计的单独实验中,在脂多糖激发后2小时检查血清TNF-α(每组n=6)。

 

 

结果

1、电针预处理合谷改善致死性内毒素血症大鼠存活率

在脂多糖激发之前在非穴位接受电针治疗的20只大鼠中有3只在内毒素血症中存活(图1)。在脂多糖激发之前对合谷穴进行电针提供了显着的保护:20只大鼠中有16只在内毒素血症中存活(P   <0.0001 对比   空白对照中的4/20)。在7天的观察期内没有进一步的死亡表明电针预处理给予了持久的保护,并且不仅仅延迟了死亡的发生。在脂多糖激发前接受内关电针治疗的大鼠的保护作用较小(存活率:10/20; P   = 0.049 vs.  合谷)。当在脂多糖激发后干预时,电针治疗不影响合谷或内关的存活率。

2、电针预处理减弱脂多糖的全身炎症反应

图 2A显示在脂多糖激发后2小时血清TNF-α约为900pg / ml,并在4和6h时降至低于60pg/ml的水平。合谷电针预处理在脂多糖攻击后2小时显著降低血清TNF-α水平。4和6小时的TNF-α水平未受影响。图2B显示在脂多糖激发后2小时血清IL-1β约为1,000pg/ml,并在脂多糖激发后4小时达到平台期。合谷的电针预处理在整个观察期内显着降低IL-1β(P<0.0001)。图2C显示在脂多糖激发后2小时血清IL-6约为6,500pg/ml,并在脂多糖激发后4小时达到平台。合谷的电针预处理在整个观察期内显着降低IL-6(P<0.0001)。图 2D显示抗炎细胞因子IL-10不受电针预处理的影响。

 

 

图2 电针合谷穴预处理对血清炎症因子的影响

 

3、电针预处理的保护作用不能归因于下丘脑-垂体-肾上腺轴的激活

接受脂多糖激发的大鼠血清皮质类固醇通过合谷穴以及非穴位的电针预处理显着降低而非增加(两者均P   <0.0001; 图3)。单独对合谷穴或非穴位进行电针治疗也会显着降低未接触脂多糖的大鼠的血清皮质类固醇水平(  两者均P <0.0001; 图3)。因此,电针的有益效果与增加皮质类固醇水平无关。

 

 

图3 电针预处理对血清皮质酮水平的影响

4、周围交感神经系统和特别是β-肾上腺素能受体,但不增加中枢交感神经张力,是电针保护作用所必需的

在脂多糖刺激前,给予鸟嘌呤消融交感神经系统显着提高存活率(10/20 与 3/20的对照组大鼠; P= 0.025)和血清TNF-α水平减弱(P <0.0001)。然而,电针合谷预处理并没有为交感神经切除的大鼠提供进一步的保护作用( 没有电针的交感神经切除大鼠的存活率:8/20vs. 10/20; P=0.66; 图4)。此外,有或没有电针预处理的交感神经切除大鼠的血清TNF-α水平没有差异(P=0.49; 图 4B)。用β-拮抗剂普萘洛尔预处理完全消除了电针对存活和血清TNF-α的影响。而不是α-拮抗剂酚妥拉明。出人意料的是,预处理可乐定,中枢作用的α2-激动剂的是减小中央交感紧张,没有阻断电针的影响(存活率:18/20; P=0.44; TNF-α:P=0.68;图4E和F)。

 

 

图4 外周交感神经切除术或β-肾上腺素受体阻滞而不是中枢性交感神经阻滞,抑制了电针的保护作用。

5、中枢毒蕈碱受体,迷走神经,周围烟碱受体和脾脏是电针保护作用所必需的

       迷走神经,最近被确定为通过免疫功能是通过中枢神经系统,被称为调控的主要途径“胆碱能抗炎途径” 。我们的研究结果表明,脂多糖刺激之前显著单边(右侧)颈迷走神经切断衰减电针预处理的保护作用(图5A和B)。用烟碱拮抗剂美卡拉明进行全身治疗完全阻断了电针的保护作用,毒蕈碱拮抗剂阿托品甲基硝酸盐没有该作用(图5C和D)。直接进入大脑的阿托品甲基硝酸盐完全阻断了电针的保护作用(图5E和F)。这些结果与中枢毒蕈碱受体在调节外周细胞因子产生中的重要作用一致。最近关于胆碱能抗炎途径的解剖学基础的研究表明脾脏是迷走神经控制炎症所必需的,尽管脾神经被归类为儿茶酚胺能。在我们的研究中,虽然脾切除本身显著降低血清TNF-α水平与假手术组(图5 1H)但没有改善内毒素血症大鼠的存活率。当电针应用于脾切除的动物时,其存活增强作用消失(5G)。此外,与完整动物不同,电针未能抑制脾切除动物的血清TNF-α水(图 5H)。

 

 

图5 电针合谷的通过中枢毒蕈碱受体,迷走神经,外周烟碱受体和脾脏提高内毒素血症大鼠的存活率

 

讨论

 

        该研究首次表明,合谷穴位的电针预处理可以显着提高致死性内毒素血症大鼠的生存率。促炎细胞因子(TNF-α,IL-6和IL-1β)的产生也显着减弱,但抗炎细胞因子血清IL-10不受影响。

       该研究也证明了针灸的选择性:电针合谷穴比内关穴位的电针产生更强大的保护作用; 非穴位的电刺激没有效果。据我们所知,针灸的部位特异性影响,即具有选择性生理影响的“真正”治疗穴位尚未得到充分验证或接受。一些有影响力的偏头痛临床试验未能显示针灸选择穴位与   假针灸之间的显着差异。在目前的研究中,在电针期间使用麻醉排除了由电刺激过程引起的一些可能的非特异性生理效应,例如疼痛和固定应激,因此为位点特异性效应的存在提供了更可靠的证据。

       在这项研究中,我们发现合谷穴的电针不能增强糖皮质激素或抗炎细胞因子的释放(例如  ,IL-10),提示体液途径不是电针免疫调节功效的原因。相反,这种效应需要毒蕈碱受体参与中枢神经系统,但不会增加中枢交感神经张力。外周交感神经和副交感神经系统的协同作用而非独立作用也是必要的。乍一看,这些结果似乎难以解释或区分交感神经和副交感神经组分的作用。然而,新发现的胆碱能抗炎途径表明长期以来将控制免疫反应的神经回路分离成离散的交感神经和副交感神经组件的尝试是不精确的。我们现在主要基于胆碱能抗炎通路提出了以下框架来解释我们的发现:电针合谷激活脑毒蕈碱受体介导的网络可能通过躯体自主反射,随后增加迷走神经活动。迷走神经终止于腹腔 - 肠系膜上丛神经节的主要细胞周围的突触样结构,这是一种儿茶酚胺能脾纤维起源的部位。通过这些神经节中有两个串联的神经元,迷走神经通过烟碱乙酰胆碱受体调节脾神经的活动。由脾神经释放然后增加去甲肾上腺素的作用上的脾脏以产生乙酰胆碱的B和T细胞中表达的β肾上腺素能受体。在脾增强乙酰胆碱水平然后激活巨噬细胞上表达以抑制促炎细胞因子释放烟碱样受体。

       总之,合谷穴的电针预处理可抑制全身炎症反应,提高致死性内毒素血症大鼠的生存率。潜在的机制涉及ANS的传出神经回路的激活,例如胆碱能抗炎途径。

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