青光眼和外伤性视神经挤压伤（ONC）都会导致视网膜神经节细胞（RGC）逐渐死亡和视觉功能丧失。在中医药的临床试验中，针灸已被广泛用于治疗眼部疾病。但是，针灸治疗的分子机制仍不清楚。这项研究使用了RNA测序技术（RNA-seq）来研究针刺治疗对轴突切开术后视网膜转录组的影响。RNA-seq结果显示，包括31个转录因子（TFs）在内的436个基因在受伤后发生了变化，其中包括许多与神经变性相关的TFs，并且发现针灸风池穴（GB20）可显着逆转视神经损伤诱导的一系列差异表达基因（DEG），精明穴（BL1）或风府穴（GV16）（风池穴的假手术组）也可在一定程度逆转DEG。最后，视网膜免疫染色结果显示，只有风池（GB20）穴位治疗可提高RGC存活率，与RNA-seq结果一致。因此，我们的研究首先报道了针刺治疗可调节视网膜转录组并逆转由轴切术所致的基因表达，而GB20穴位治疗可提高RGC的存活率，这将为眼部疾病的治疗提供新的治疗靶点。

      青光眼和视神经炎等慢性眼部疾病最终导致视网膜神经节细胞（RGC）的进行性丧失和失明。视神经挤压（ONC）等外伤也导致严重的RGC死亡。

实验内容

        在这项研究中了使用ONC挤压伤小鼠模型和RNA-seq技术分析视网膜样本（有或没有视神经损伤），并筛选出ONC损伤后2天的TFs上调和下调的基因，并鉴定那些损伤诱导的基因逆转在两个不同的穴位进行针灸治疗后效果。

    为了研究表达差异，ONC后2天从GB20（ONC-F）或BL1（ONC-J）穴位针刺处理，从完整视网膜（WT），轴突化视网膜（ONC）和轴突化视网膜提取RNA。通过Bioanalyzer 2100系统评估每个样品的RNA完整性。样本总读取量介于40.80至6950万之间，映射率介于95.4至96.6％之间。

主要结果

1.针灸治疗可逆转损伤性DEG

为了研究ONC损伤后的针刺治疗效果，我们分别在ONC穴位GB20（风池），BL1（精明）或假点GV16（风府）进行了3次针刺治疗。RNA-seq分析显示：

在损伤诱导的上调DEG中，通过GB20处理可逆转20个DEG，上调6个DEG；BL1可逆转11个DEG，上调24个DEG；GV16可逆转14个DEG，上调52个DEG。 

在损伤诱导的DEG下调中，通过GB20处理可逆转21个DEG，无需下调DEG；BL1中逆转19个DEG，下调2个DEG；BL1中逆转32个DEG，下调42个DEG。

       有趣的是，穴位GB20的位置在脖子的后部，远离眼睛的位置，而针刺对视网膜基因表达的调节产生影响，这解释了为什么许多临床实践选择GB20部位来治愈眼部疾病。

2.针灸治疗可促进RGC的生存

为了测试针灸治疗如何影响ONC后RCG的实际存活，收集了对只ONC和ONC后经针刺BL1，GB20和假对照GV16穴位治疗的视网膜进行免疫染色。视网膜与RGC特异性标记RBPMS和神经元特异性标记Tuj1共染色。

结果表明，GB20穴位治疗可稍微增加视神经损伤后RGC的存活率。27％的RCG在GB20针刺条件下存活，而ONC仅18％存活。BL1和GV16对RGC存活率无显着影响，分别为18％和22％。因此，与单独的ONC相比，采用GB20穴位治疗的ONC存活的RCG多9％。

通过针灸治疗RGC存活的促进作用。（A）共聚焦图像，显示RGC与RBMPS（RGC特异性标记）和Tuj1（神经元特异性标记）的抗体共染色。（B）相对于完整幼稚视网膜RGC存活百分比的统计分析。数据表示为平均值±SEM；n = 5；*** p <0.001。

实验结论与讨论

       只有GB20处理对DEGs表达具有最佳的整体逆转作用，而GB20的假对照GV16处理则完全没有整体逆转作用，并且假针组还进一步增强了ONC损伤诱导的表达状态。此外，通过GB20处理提高RGC存活率证实了DEG逆转的神经保护作用。

     针灸治疗可能会影响视网膜的血管形成过程，并促进ONC损伤后的神经保护作用；针灸治疗可能通过背根神经节（DRG）和脊髓传递电信号，最终调节眼部血流；针灸治疗还调节了视网膜中神经生长因子和脑源性神经营养因子的表达，这可能调节视网膜基因的表达并提供神经保护作用。

      由于GB20的治疗稍微增加了RGC的存活率，因此接下来我们将研究GB20参与RGC保护的详细机制。